Существует два подхода к клонированию ДНК. Первый подход предполагает использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК. Второй способ представляет собой амплификацию ДНК in vitro.

Клонирование ДНК in vivo

Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую .

Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.

Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика », так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.

Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.
Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком.
Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.

Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК .

Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается.
Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг . Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.

Геномные библиотеки, клонирование ДНК in vivo

После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить, т.е. клонировать. Цель: получить многочисленные копии желаемых генов. Для клонирования небольших фрагментов ДНК используют плазмиды или фаговые ДНК, для крупных – космиды и искусственные хромосомы.

Существует два подхода к клонированию ДНК:

1) использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК.

2) амплификация ДНК in vitro.

Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую .

Геномная библиотека – это коллекция клонов ДНК, включающая все фрагменты, входящие в геном данного вида. Т. е. банк генов еще можно назвать набором клонированных фрагментов генома. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.

Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика », так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.

Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.

Для создания банка генов необходимо:

1) выделение всей геномной ДНК

2) фрагментация ДНК рестриктазами или ультразвуком

3) Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают той же рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК добавляют к плазмидной в присутствии лигаз. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК

4) рекДНК вводят в бактериальные или дрожжевые клетки, где плазмида реплицируется с образованием многих копий.

5) Клонирование бактерий: каждая возникшая колония клеток представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид образует библиотеку геномной ДНК .

Недостаток. фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.

Достоинство: библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго.

-источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функции белков

-сохранение генофонда исчезающих видов

Аналогичные коллекции, полученные из индивидуальных хромосом или их частей, называются хромосомными библиотеками.

Клонирование ДНК. Этапы клонирования днк. Рестрикционные ферменты. Рестриктазы. Эндонуклеазы.

Клонирование ДНК in vivo включает 6 этапов:
1) получение фрагментов ДНК, в том числе генов или их частей с помощью ферментов рестрикции;
2) рекомбинация фрагментов,
3) вставка фрагмента ДНК в вектор;
4) трансформация с помощью вектора организма хозяина;
5) скрининг на рекомбинантный вектор
6) отбор интересующих исследователя клонов.

Некоторые рестриктазы, а также последовательности нуклеотидов, которые они распознают, и сайты рестрикции в этих последовательностях

Рестрикционные ферменты. Рестриктазы. Эндонуклеазы.

В каждой хромосоме человека имеется только одна непрерывная нить ДНК. Она сложно упакована для того, чтобы поместиться в хромосоме. Манипулировать с молекулой ДНК такой длины практически невозможно.

Поэтому открытие в 70-х годах XX в. особых бактериальных ферментов. разрезающих ДНК на отдельные фрагменты, было очень кстати. Ферменты были названы рестриктазами или эндонуклеазами.

У бактерий эти ферменты служат для защиты от проникновения в клетку чужеродной ДНК. Обычно рестриктазы распознают так называемые палиндромные последовательности нуклеотидов, наблюдающиеся в двух нитях ДНК и состоящие из 4—6 нуклеотидов.

«Палиндромные » означает одинаковые последовательности нуклеотидов, если их читать в одном и том же направлении, например от 5'- к 3'-концу в обеих комплементарных нитях ДНК.

Примеры нескольких рестриктаз показаны в таблице.

Геномные библиотеки, клонирование ДНК in vivo.

После того, как ДНК сшита в пробирке, ее нужно размножить, т.е. клонировать. Цель: получить бессчетные копии хотимых генов. Для клонирования маленьких фрагментов ДНК употребляют плазмиды либо фаговые ДНК, для больших – космиды и искусственные хромосомы.

Существует два подхода к клонированию ДНК:

1) внедрение бактериальных либо дрожжевых клеток для размножения введенной в их чужеродной ДНК.

2) амплификация ДНК in vitro.

Используя мельчайшие организмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую .

Геномная библиотека – это коллекция клонов ДНК, включающая все куски, входящие в геном данного вида. Т. е. банк генов еще можно именовать набором клонированных фрагментов генома. Если геном какого-нибудь организма разрезать, воткнуть в плазмидные либо вирусные вектора и ввести в клеточку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной либо фаговой ДНК возможность выпадения целых и неизмененных кусков генома достаточно высока.

Таковой метод получения геномной библиотеки получил заглавие «метод дробовика», потому что геном в этом случае представлен отдельными кусками.

Принципы сотворения плазмидных и вирусных векторов общие, потому разглядим их на примере плазмидных. Из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, потому что они имеют огромную емкость и позволяют вставлять более большие кусочки генома.

Для сотворения банка генов нужно:

1) выделение всей геномной ДНК

2) фрагментация ДНК рестриктазами либо ультразвуком

3) Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают той же рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК добавляют к плазмидной в присутствии лигаз. Таким макаром получают рекомбинантную плазмидную ДНК

4) рекДНК вводят в бактериальные либо дрожжевые клеточки, где плазмида реплицируется с образованием многих копий.

5) Клонирование микробов: любая появившаяся колония клеток представляет собой клон либо потомство одной клеточки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупа плазмид образует библиотеку геномной ДНК.

Недочет: куски ДНК образуются в неограниченном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, потому только часть фрагментов содержат настоящие гены. Некие куски могут содержать только часть гена либо же интронные последовательности.

Достоинство:библиотека генов может храниться и употребляться неограниченно длительно.

-источник материала для исследования структуры, функции и регуляции личных генов, структуры и функции белков

-сохранение генофонда исчезающих видов

Подобные коллекции, приобретенные из личных хромосом либо их частей, именуются хромосомными библиотеками.

Возможно Вам будут интересны работы похожие на: Геномные библиотеки, клонирование ДНК in vivo.

Open Source Content Management

Пишем и решаем по Микробиологии любые темы и вопросы! Выполнение в кратчайшие сроки по приятным ценам! Заполните форму ниже, и получите ответ в течении 15 минут.

Клонирование генов– это процедура, включающая выделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- или эукариотических. С информационной РНК, выделяемой из однотипных клеток организма, снимают ДНК-копии , которые затем вводят в реципиентные клетки, и амплифицируют. Клонирование ДНК in vivo включает 4 этапов:

4) трансформация с помощью вектора организма хозяина;

5) скрининг на рекомбинантный вектор

6) отбор интересующих исследователя клонов.

Реципиентные клетки – клетки, выбранные для клонирования гена, могут быть как про-, так и эукариотическими.

мРНК выделяют из клеток или тканей, в которых экспрессируется искомый ген.

Синтез ДНК - копий осуществляется ферментом РНК-зависимой ДНК-полимеразой. Чтобы этот

фермент начал работать, требуется короткая одноцепочечная ДНК-затравка; для этой цели, как правило, используют oligo. Затравочная ДНК самопроизвольно образует двухцепочечный комплекс с отрезком poly.

Деполимеризацию исходной РНК-цепочки осуществляют путем щелочного гидролиза. Цепи ДНК

устойчивы к обработке щелочью, а РНК полностью деполимеризуется. Получившаяся в результате ДНК является одноцепочечной.

Двухцепочечную кДНК получают путем достраивания оц-кДНК до двухцепочечной формы, выполняемого ферментом ДНК-полимеразой I. Такую кДНК можно встраивать в вектор.

Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды и бактериофаги.

Плазмиды — это встречающиеся в клетках внехромосомные элементы, представляющие собой замкнутые кольцевые молекулы дц-ДНК. Чтобы включить кДНК в плазмиду, замкнутое кольцо плазмиды надо «разомкнуть». Для этого плазмиды подвергают воздействию рестриктаз.

Рестриктаза - разрезает дц-ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, называемым участками рестрикции.

Сшивание — процедура, в ходе которой чужеродная ДНК встраивается между — это процедура, необходимость применения которой обусловлена тем, что в исходном препарате кДНК представлено много разных мРНК и лишь часть плазмид несет нужный нам ген.

Амплификация осуществляется благодаря тому, что в одной бактериальной клетке может синтезироваться много копий интересующей нас плазмиды, а также за счет получения большого количества клеток с такими плазмидами. После выделения и очистки плазмиды обрабатывают соответствующей рестриктазой, которая вырезает встроенные в них копии искомого гена. Амплифицированный таким образом ген можно использовать для дальнейших экспериментов в области генной инженерии.

Источники: www.biotechnolog.ru, studopedia.ru, dommedika.com, reftrend.ru, biologymic.ru