Клонирование ДНК — использование технологии рекомбинантных ДНК для выделения и размножения определенной нуклеотидной последовательности, содержащейся в сложной смеси фрагментов ДНК. Для этой цели первоначально все фрагменты ДНК смеси внедряют в клонирующий вектор , затем с помощью скрининга отбирают среди них рекомбинантные молекулы, содержащие целевой фрагмент ДНК, напр. ген , а затем осуществляют их размножение путем введения отобранной рекомбинантной ДНК в подходящую клетку-хозяина, напр. в клетку кишечной палочки.

Клонирование ДНК. Этапы клонирования днк. Рестрикционные ферменты. Рестриктазы. Эндонуклеазы.

Клонирование ДНК in vivo включает 6 этапов:

1) получение фрагментов ДНК, в том числе генов или их частей с помощью ферментов рестрикции;

2) рекомбинация фрагментов,

3) вставка фрагмента ДНК в вектор;

4) трансформация с помощью вектора организма хозяина;

5) скрининг на рекомбинантный вектор

6) отбор интересующих исследователя клонов.

Некоторые рестриктазы, а также последовательности нуклеотидов, которые они распознают, и сайты рестрикции в этих последовательностях

Рестрикционные ферменты. Рестриктазы. Эндонуклеазы.

В каждой хромосоме человека имеется только одна непрерывная нить ДНК. Она сложно упакована для того, чтобы поместиться в хромосоме. Манипулировать с молекулой ДНК такой длины практически невозможно.

Поэтому открытие в 70-х годах XX в. особых бактериальных ферментов. разрезающих ДНК на отдельные фрагменты, было очень кстати. Ферменты были названы рестриктазами или эндонуклеазами.

У бактерий эти ферменты служат для защиты от проникновения в клетку чужеродной ДНК. Обычно рестриктазы распознают так называемые палиндромные последовательности нуклеотидов, наблюдающиеся в двух нитях ДНК и состоящие из 4—6 нуклеотидов.

«Палиндромные » означает одинаковые последовательности нуклеотидов, если их читать в одном и том же направлении, например от 5'- к 3'-концу в обеих комплементарных нитях ДНК.

Примеры нескольких рестриктаз показаны в таблице.

Клонирование днк

Клонирование днк

Клонирование ДНК является отправной точкой для многих биотехнологических исследований в подходах генной инженерии. Большое количество ДНК необходимо для манипуляций генной инженерии. Несколько копий кусочка ДНК может быть сделано либо с помощью полимеразной цепной реакции или путем клонирования ДНК в клетках.

Как ДНК клонируют в клетках? Чтобы получить несколько копий гена или другой части ДНК необходимо изолировать, или «отрезать» ДНК от источника, а затем «вставить» его в ДНК-векторы, которые могут воспроизводиться себя.

Четырьмя основными шагами в клонировании ДНК являются:

1. Выбор области ДНК, который отделяется от исходного организма с помощью ферментов рестрикции.

2. Отрезанный кусок вставляется в вектор и концы ДНК соединяются с векторной ДНК путем лигирования.

3. Вектор вводят в клетку-хозяина . Клетки-хозяева будут копировать векторную ДНК вместе с их собственной ДНК, создавая множественные копии встроенной ДНК.

4. Векторную ДНК выделяют из ДНК и очищают клетки-хозяева.

ДНК, которая была «вырезана и вставлена» из организма, в вектор, называется рекомбинантной ДНК. Из-за этого такая технология клонирования и носит название «технология рекомбинантной ДНК»

Клонирование ДНК используется для создания большого числа копий гена или другой части ДНК.КлонированнаяДНК может быть использована для изучения функций и особенностей гена или для изучения влияния мутаций на ген.

Схема клонирования ДНК

Клонирование динозавров в России.

Клонирование ДНК это:

Содержание

Рестрикция— лигирование

В классических методиках рестрикции и лигирования, клонирование фрагмента ДНК включает четыре стадии: разрезание ДНК эндонуклеазами рестрикции. лигирование ДНК с вектором. трансфекция и последующий скрининг .

Выделение вставки

Первоначально необходимо выделить участок ДНК для клонирования. Часто препарат ДНК для клонирования получают при помощи полимеразной цепной реакции. а также разрезания ДНК рестриктазами. обработкой ДНК ультразвуком. фракционированием при помощи агарозного электрофореза ДНК. Выделение вставки может быть сделано технологией клонирования шотган, комплементарной ДНК. искусственным химическим синтезом.

Трансформация

После лигирования плазмидой трансформируют бактерии для наращивания. Бактерии далее выращивают на селективной среде для отбора колоний, содержащих встройку. Индивидуальные колонии отбирают и изучают на наличие встройки.

Трансфекция

После лигирования реакционную смесь со встроенным в требуемой ориентации вектором помещают в клетки. В зависимости от типа клеток используют химическую сенситизацию клеток, электропорацию или генные пушки. Для химической сенситизации не требуется специальное оборудование. Электропорацию используют в случае необходимости высокой эффективности трансфекции. Генные пушки применяют в случае растительных клеток и тканей, так как клеточная стенка растений не дает чужеродной ДНК проникать в цитоплазму и ядро.

Получают культуры трансфецированных клеток. Так как описанные выше процедуры часто имеют низкую эффективность, требуются способы выявления клеток, содержащих требуемую вставку в правильной ориентации и отделение таких клеток от не содержащих вставки. Современные векторы для клонирования содержат селективные маркеры которые дают возможность расти только клеткам с правильной вставкой расти на селективной среде . Векторы для клонирования также часто содержат маркеры, обуславливающие окраску колоний, например при выращивании на среде, содержащей X-gal. Для точного подтверждения успешного клонирования, требуется проверка при помощи полимеразной цепной реакции , полиморфизма длин рестрикционных фрагментов или секвенирования ДНК .

Генная терапия

Генная терапия подразумевает введение работающего гена в клетки, в которых он отсутствует, что приводит к излечению болезни, связанной с отсутствием или неправильным функционированием гена. Генную терапию классифицируют на две категории. В первом случае мутации содержатся в стволовых или половых клетках, тогда весь организм и все потомки имеют дефект. Во втором случае мутация возникает в соматических клетках. возможна пересадка модифицированных клеток или тканей. Клинические испытания генной терапии соматическими клетками начались в конце 1990-х, для лечения рака крови, печени и легких.

Клонирование: правда и вымысел

Компьютерный синтез и клонирование речи pdf 10,2Мб

Компьютерный синтез и клонирование речи

Компьютерный синтез и клонирование речи

Компьютерный синтез и клонирование речи

Клонирование бизнеса. Франчайзинг и другие модели быстрого роста

Alcatel, Motorola, Nokia, Siemens, Samsung, SonyEricsson, схемы, телефон, мобильник, сотовый, программирование, SIM-карта, кабели, клонирование, радиолюбитель

Численные методы, Книга 2, Методы математической физики, Калиткин Н.Н. Корякин П.В. 2013

Экономико-математические методы, Элементарная математика и логика, Методы исследования операций, Абчук В.А. 1999

Методы фармакогностического анализа лекарственного растительного сырья, часть1: Правила приемки и общие методы испытаний. Учебное пособие..

Источники: humbio.ru, dommedika.com, dnkworld.ru, dic.academic.ru, books.tr200.net